Archivo del Autor: Adrián Contreras Garrido

Sistemas miniaturizadosSistemes miniaturizatsMiniaturized systems

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Una de las tendencias actuales en muchas áreas del conocimiento, incluida la microbiología, está dirigida hacia la miniaturización, automatización,   simplificación, el ahorro de reactivos  y la disminución de desechos.

Los sistemas miniaturizados son métodos rápidos que permiten la identificación de microorganismos a través de la realización de diferentes pruebas bioquímicas. Estos sistemas consisten en un dispositivo de plástico con varios microtubos que contienen diferentes medios de cultivo deshidratados o diferentes sustratos de enzimas de acuerdo al tipo de prueba que se requiere montar. El sistema que utilizamos en las prácticas es el sistema API  20E, aquí un resumen, pero también existen otros sistemas como este.

Si una imagen vale más que mil palabras, 3 vídeos valdrán mucho más. A si que aquí tenéis una explicación en vídeo del uso del sistema API:

Una de les tendències actuals en moltes àrees del coneixement, inclosa la Microbiologia, està dirigida cap a la miniaturització, automatització, simplificació, l’estalvi de reactius i la disminució de desfets.

Els sistemes miniaturitzats són mètodes ràpids que permeten la identificació  de microorganismes a través de la realització de diferents proves bioquímiques. Aquests sistemes consisteixen en un dispositiu de plàstic amb diversos microtubs que contenen diferents medis de cultius deshidratats o diferents substrats d’enzims d’acord al tipus de prova que es vol muntar. El sistema que utilitzem en les pràctiques del grau de Biologia és el sistema API 20E, açí un resum, però  també existeixen altres sistemes com este.

Si una imatge val més que mil paraules, 3 vídeos valdran molt més. Així que ací teniu una explicació en vídeo de l’ús del sistema API:

One of the actuals trends in many areas of knowledge, even in microbiology, is aimed toward automatization, minitiaurization, simplification, save resources and waste reduction.

Miniaturized systems are quick methods that allow correct identification of microorganism trough many different biochemical tests. These systems consist in a plastic device with microtubes which contain different dehydrated growth media or different enzyme substrate. The exact media or substrate depends of the test.  In our microbiology practices we use API 20E system, here a detailed description of the method, but there are other systems also, like this one.

If an image works better than 1000 words, 3 videos works even better. So here you get a video explanation of the use of API system:

Tinciones diferenciales: Tinción de GramTincions diferencials: Tinció de Gram Differential staining: Gram stain

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 Procedimiento que se utiliza para diferenciar organismos en base a sus distintas características tinción. La tinción de Gram es el método de tinción más ampliamente utilizado en bacteriología.

El primer paso consiste en teñir el frotis con cristal de violeta (colorante básico), el colorante primario. A continuación  se trata con una solución yodada que actúa como mordiente. El yodo intensifica las interacciones entre el colorante y la célula de manera que esta se tiñe más intensamente. Posteriormente se decolora el frotis lavándolo con acetona o etanol. Así las bacterias gramnegativas perderán la coloración sin embargo, otras retienen el cristal de violeta, las bacterias grampositivas. Finalmente el frotis se tiñe de nuevo, tinción de contraste, con un colorante básico de un color diferente al del cristal de violeta. La safranina, el colorante de contraste más común tiñe las bacterias gramnegativas de rosa a rojo.

Procediment que s’utilitza per diferenciar organismes segons les seves diferents característiques de  tinció. La tinció de Gram és el mètode de tinció més àmpliament utilitzat en bacteriologia.

El primer pas consisteix a tenyir el frotis amb cristal de violeta (colorant bàsic), el colorant primari. A continuació es tracta amb una solució iodada que actua com mordent. El yodo intensifica les interaccions entre el colorant i la cèl · lula de manera que aquesta es tenyeix més intensament. Posteriorment es descoloreix el frotis rentant amb acetona o etanol.Així els bacteris gram-negatius perdran la coloració però, altres retenen el cristall de violeta, els bacteris gram-positius.

Finalment el frotis es tenyeix de nou, tinció de contrast, amb un colorant bàsic d’un color diferent al del cristal de violeta. La safranina, el colorant de contrast més comú tenyeix els bacteris gramnegatius de rosa a vermell.

Procedure used to differentiate organisms based on their different characteristics staining.

Gram staining is the staining method most widely used in bacteriology, the first step is to stain the smear with crystal violet (basic dye), the primary stain. It is then treated with an iodine solution which acts as a mordant. Iodine enhances interactions between the dye and the way this cell is stained more intensely. Then the smear decolorized with acetone or ethanol washing. Thus negative bacteria lose coloration however, other crystal violet retain the gram-positive bacteria. Finally the smears stained again counterstaining with a basic dye of a different color from violet crystal. Safranin, the contrast dye stains the most common Gram-negative bacteria from pink to red.

Preparación y tinción de muestrasPreparació i tinció de mostresPreparing and staining samples

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Para poder observar un grupo de bacterias, normalmente se prepara una muestra en un porta  que será colocado en el microscopio. La preparación de la muestra empieza por la fijación de la muestra al porta y  termina con la coloración de los organismos.

Fijación: proceso por el cual se preservan y se fijan en una posición los microrganismos de la forma más parecida posible a la de las células vivas. Este proceso es necesario para la posterior tinción de la muestra. Fundamentalmente, existen dos tipos diferentes de fijación.

La fijación por calor se utiliza de forma rutinaria para observar procariotas. Normalmente una película de células (un frotis) se calienta suavemente pasando el portaobjetos por una llama. La fijación por calor preserva la morfología global pero no las ultraestructuras.

La fijación química se utiliza para proteger las subestructuras celulares finas y la morfología de los microrganismos más grandes. Los fijadores químicos penetran en la célula y reaccionan con los componentes celulares, normalmente se unen a proteínas y lípidos para inactivarlos, insolubilizarlos e inmovilizarlos. Las mezclas comunes de fijadores contienen sustancias como etanol,  ácido acético, cloruro de mercurio, formaldehído y glutaraldehído.

En este video de YouTube una señora nos explica cómo hacer un frotis desde un cultivo en tubo y, posteriormente, una fijación por calor 

Colorantes y tinción simple: Los numerosos tipos de colorantes utilizados para teñir microorganismos tienen dos características en común: contienen grupos cromóforos, grupos con dobles enlaces conjugados que dan al colorante su color, y pueden unirse a las células por medio de enlaces iónicos covalentes o hidrófobos. La mayoría de colorantes se utilizan para teñir directamente el objeto de interés pero algunos colorantes como la tinta china y la nigrosina se utilizan en  tinciones negativas, en las que lo que se tiñe no es la célula si no el fondo, las células aparecen como objetos brillantes en un fondo oscuro.

Los colorantes que se unen a las células por interacciones iónicas son los más utilizados. El pH puede modificar la eficacia de tinción de estos colorantes ya que la naturaleza y cantidad de cargas en los componentes celulares varía con el pH.

Pero… ¿Cómo se hace una tinción? En este video de YouTube nos lo explican bastante bien aunque, como viene siendo habitual, en inglés:

 

Per poder observar un grup de bacteris, normalment es prepara una mostra en un porta que serà col · locat al microscopi. La preparació de la mostra comença per la fixació de la mostra al porta i acaba amb la coloració dels organismes.

Fixació.

Procés pel qual es preserven i es fixen en una posició els microorganismes de la manera més semblant possible a la de les cèl · lules vives. Aquest procés és necessari per a la posterior tinció de la mostra. Fonamentalment, hi ha dos tipus diferents de fixació: la fixació per calor y la fixació química.

En aquet vídeo se nos explica cómo hacer un frotis desde un cultivo en tubo y, posteriormente, una fijación por calor.

Colorants y tinció simple

Els nombrosos tipus de colorants utilitzats per tenyir microorganismes tenen dues característiques en comú: contenen grups cromòfors, grups amb dobles enllaços conjugats que donen al colorant el seu color, i poden unir-se a les cèl · lules per mitjà d’enllaços iònics covalents o hidròfobs. La majoria de colorants s’utilitzen per tenyir directament l’objecte d’interès però alguns colorants com la tinta xinesa i la nigrosina s’utilitzen en tincions negatives, en les que el que es tenyeix no és la cèl · lula sino el fons, les cèl · lules apareixen com objectes brillants en un fons fosc.

Els colorants que s’uneixen a les cèl · lules per interaccions iòniques són els més utilitzats. El pH pot modificar l’eficàcia de tinció d’aquests colorants ja que la naturalesa i quantitat de càrregues en els components cel · lulars varia amb el pH.

Però… Com es fa una tinció? En aquet video  ens ho expliquen prou bé encara que, com és habitual, en anglès

.

To observe a sample of microorganism, they usually prepare the sample in a slide, which will be place in the microscopy. The preparation of the sample starts fixing it in the slide and ends with the stain of the microorganism.

Fixation

In this process structures and cells will be preserved and fixed in a permanent position in the closest shape to the living cell. This step is necessary to the stained of the sample. There are two different types of fixation: Heat fixation and chemist fixation

This video shows how make a heat fixation and smear from a tube culture.

Biological Stains and simple staining

There are many different biological stains but they have two common characteristics: All contain  chromophore groups, this groups contains  conjugated double bonds that give their specific colour; and can join to the cells by ionic or hydrophobic bonds. Most of these dyes are used to stain the microorganisms but some of they, like chinese dye and nigrosina are used on negative stain, which involves stain the background not the microorganism. The cells appear like bright objects in a dark background.

The dyes that link cells by ionic interactions are the most used. The efficiency of the dyes can be modify by pH. That is because the number and type of the cellular charges can be also modify by the pH.

But… ¿How we make a stain? In this video you can see and explanation of this method.

Método de siembra en estríaMétodo de siembra en estríaStreaking method

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La técnica de siembra en estría es usada para aislar cepas puras en una placa Petri a partir de un inóculo o muestra con diferentes especies.  La técnica consiste en, mediante un asa de siembra previamente esterilizada, rayar la superficie de cultivo de una placa Petri de forma que en cada pasada sea menor el número de  células depositado, las últimas pasadas deberán
depositar un número tan bajo de células que, una vez incubadas, se formen colonias puras. Aquí teneis un video explicativo: 

La tècnica de sembra en estria és usada per aïllar soques pures en una placa Petri a partir d’un inòcul o mostra amb diferents espècies. La tècnica consisteix en, mitjançant una ansa de sembra prèviament esterilitzada, ratllar la superfície de cultiu d’una placa Petri de manera que en cada passada sigui menor el nombre de cèl · lules dipositat, les últimes passades deuran dipositar un nombre tan baix de cèl · lules que, una vegada incubades, es formin colònies pures.

Açí teniu un video explicatiu:

This method is useful for isolating pure colonies in a Petri dish from an inoculation or sample with different species. Streaking the surface of a Petri dish with a sterilized inoculation loop, you will drag a decreasing number of cells in each spread. The last stread should deposit just single bacterial cells that can grow into a pure colony.

Here you have an explanation video:

Replicación por círculo rodanteReplicació per cercle rodantRolling circle replication

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La replicación por círculo rodante es un mecanismo utilizado por algunas bacterias y virus que difiere de la replicación semiconservativa típica. En bacterias es utilizada para trasmitir un plásmido mediante conjugación. En el bacteriófago lambda el proceso ocurre al entrar en modo lítico, como forma de generar nuevas réplicas del genoma del fago. Aunque este mecanismo tiene múltiples variaciones, sobretodo en virus, básicamente se podría resumir así:

La síntesis de DNA  comienza  con el corte en una cadena (morada) en el origen de replicación, el extremo 5´ se aleja del dúplex, permitiendo la adición de desoxirribunucleotidos al extremo 3´ libre, que tomarán como molde la cadena complementaria.

Mientras ocurre esto, el extremo 5´ de la cadena cortada se despliega como una cadena libre de tamaño cada vez mayor.

Cuando toda  esta cadena se ha desplegado, el extremo 3´ se ha disociado de la cadena complementaria,  la maquinaria de replicación corta y liga los dos extremos formando nuevamente una molécula de DNA monocatenario y dejando tras de sí un DNA circular de doble cadena, una de las cadenas es de nueva síntesis (rosa) y la otra corresponde a la cadena molde (azul).

EL DNA monocatenario (morado) deberá sintetizar su cadena complementaria para convertirse nuevamente en un DNA de doble cadena.

Aquí os dejo un par de animaciones muy buenas del proceso:

http://highered.mcgrawhill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter13/animation_quiz_6.html

http://www.wwnorton.com/college/biology/mbio/animations/main.asp?chno=ch07a05

Detalle de la transferencia de un plásmido por replicación por circulo rodante.

La replicació per cercle rodante és un mecanisme utilitzat per algunes bacteries i virus que diferix de la replicació semiconservativa típica. En bacteris és utilitzada per a transmetre un plasmidi per mitjà de conjugació. En el bacteriòfag lambda el procés ocorre a l’entrar en mode lític, com a forma de generar noves rèpliques del genoma del fago. Encara que este mecanisme té múltiples variacions, sobretot en virus, bàsicament es podria resumir així:

 

La síntesi de ADN comença amb el tall en una cadena (morat) en l’origen de replicació, l’extrem 5´ s’allunya del dúplex, permetent l’addició de desoxirribunucleotids a l’extrem 3´ lliure, que prendran com a motle la cadena complementària.

Mentres ocorre açò, l’extrem 5´ de la cadena cortada es desplega com una cadena lliure de grandària cada vegada major. Quan tota esta cadena s’ha desplegat, l’extrem 3´ s’ha dissociat de la cadena complementària, la maquinària de replicació curta i lliga els dos extrems formant novament una molècula de ADN monocatenari i deixant després de de si un ADN circular de doble cadena, una de les cadenes és de nova síntesi (rosa) i l’altra correspon a la cadena motle (blau). EL ADN monocatenari (morat) haurà de sintetitzar la seua cadena complementària per a convertir-se novament en un ADN de doble cadena.

Ací vos deixe un parell d’animacions molt bones del procés:

http://highered.mcgrawhill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter13/animation_quiz_6.html

http://www.wwnorton.com/college/biology/mbio/animations/main.asp?chno=ch07a05

Detall de la transferència d’un plasmidi per replicació per circle rodant.

Rolling circle replication is a mechanism used by some bacteria and virus that differs from the typical semiconservative replication. In bacteria is used to transmit a plasmid by conjugation. In bacteriophage lambda the process occurs when lytic cycle starts, as a way to replicate the phage genome. Although this mechanism has multiple variations, especially in virus, basically could be summarized as follows:

DNA synthesis begins with a cut in a chain (purple) in the origin of replication, the 5′ moves away from the duplex, allowing the addition of deoxyribonucleotides to the free 3′ end taking the complementary strand as template.

As this occurs, the 5 ‘end of the cut string unfolds like a free chain of increasing size.

When this chain  has finally unfolded , the 3′ end has dissociated from the complementary strand, the replication machinery cuts and binds the two ends to form again a single stranded DNA molecule and leaving behind a circular double-stranded DNA, one is the newly synthesized chain (pink) and the other one is the template strand (blue).

Single-stranded DNA (purple) must synthesize its complementary strand to become again a double-stranded DNA.

Here there are a couple of amazing animations about this mechanism

http://highered.mcgrawhill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter13/animation_quiz_6.html

http://www.wwnorton.com/college/biology/mbio/animations/main.asp?chno=ch07a05

Detail of the transference of a plasmid by Rolling Circle Replication