Detección de bacterias en alimentos mediante técnicas macromoleculares.Detecció de bacteris en aliments mitjançant tècniques moleculars.Detection of bacteria presence in food products using macromolecular techniques.

La importancia de los microorganismos en los alimentos es evidente tanto por su acción en la producción de los mismos como en la alteración de los alimentos. La degradación y el deterioro de los alimentos ocasionan pérdidas en el sector económico y, lo que es más importante, provoca riesgos desde el punto de vista sanitario. En este sentido se desarrollan activamente técnicas de detección y control microbiológico de alimentos.

Leuconostoc mesenteroides es una bacteria del ácido láctico (LAB) gram-positiva, como todo el género Leuconostoc, que puede provocar infecciones en seres humanos debido a la presencia de esta bacteria en algunos productos cárnicos, aunque raramente. Por ello los Kits de detección  comerciales de microorganismos a menudo no detectan  a estos. Se desarrolló un protocolo para identificar a esta bacteria. Se basaron en una PCR de tiempo real (qPCR) con el  empleo de sondas TaqMan. Las sondas TaqMan identifican, mediante fluorescencia, un producto específico de la PCR. Se trabajó sobre el gen 23S rRNA, a partir del cual se desarrollaron los cebadores de la qPCR y la sonda TaqMan a utilizar. Para probar la especificidad del protocolo se realizaron ensayos con DNA de otras bacterias del género Leuconostoc y DNA de diversa procedencia. El resultado fue la detección exitosa de la presencia de Leuconostoc mesenteroides en productos cárnicos con un umbral mínimo de 104 CFU/g, es decir, 104 unidades formadoras de colonias por gramo.

Este trabajo fue realizado por Rosa Aznar Novella, Catedrática investigadora  en el departamento de Microbiología y Ecología de la Universidad de Valencia, cuya área de trabajo actual se centra en la detección temprana de bacterias y otros microorganismos en alimentos.  La herramienta de trabajo más utilizada es la PCR de tiempo real, mediante la cual  se crean protocolos de identificación rápidos y fiables de la presencia de estos microorganismos en los alimentos. El trabajo anterior es un buen  ejemplo del procedimiento que suele llevar a cabo en sus investigaciones.

Además de la realización de estos protocolos, se ensaya con el uso de Propidio de monoazida (PMA) combinado con una PCR en tiempo real.  El PMA se intercala con el DNA  extracelular ya que es impermeable a la membrana y, por lo tanto, inaccesible al DNA intracelular.  Al intercalarse en el DNA extracelular este no puede ser replicado en una PCR y, por lo tanto, solo se formará producto a partir de DNA intracelular.

Dicho de otra manera, el tratamiento de una muestra con PMA antes de una qPCR permite que DNA de microorganismos muertos no sea replicado y solo se forme producto de DNA proveniente de células vivas.

La técnica PMA-qPCR ha sido probada como método sustitutivo al recuento en placa como método de evaluación de procedimientos desinfectantes en los últimos trabajos realizados por este equipo de investigación como este de aquí o este otro.La importància dels microorganismes en els aliments és evident tant per la seva acció en la producció dels mateixos com en l’alteració dels aliments. La degradació i el deteriorament dels aliments ocasionen pèrdues en el sector econòmic i, el que és més important, provoca riscos des del punt de vista sanitari. En aquest sentit es desenvolupen activament tècniques de detecció i control microbiològic d’aliments.

Leuconostoc mesenteroides és un bacteri de l’àcid làctic (LAB) gram-positiva, com tot el gènere Leuconostoc, que pot provocar infeccions en éssers humans a causa de la presència d’aquest bacteri en alguns productes carnis, encara que rarament. Per això els Kits de detecció comercials de microorganismes sovint no els detecten. Es va desenvolupar un protocol per identificar aquest bacteri. Es van basar en una PCR de temps real (qPCR) amb l’ús de sondes TaqMan. Les sondes TaqMan identifiquen, mitjançant fluorescència, un producte específic de la PCR. Es va treballar sobre el gen 23S rRNA, a partir del qual es van desenvolupar els encebadors de la qPCR i la sonda TaqMan a utilitzar. Per provar l’especificitat del protocol es van realitzar assajos amb DNA d’altres bacteris del gènere Leuconostoc i DNA de diversa procedència. El resultat va ser la detecció exitosa de la presència de Leuconostoc mesenteroides en productes carnis amb un llindar mínim de 104 CFU / g, és a dir, 104 unitats formadores de colònies per gram.

Aquest treball va ser realitzat per Rosa Aznar Novella, Catedràtica investigadora al departament de Microbiologia i Ecologia de la Universitat de València, l’àrea de treball actual es centra en la detecció primerenca de bacteris i altres microorganismes en aliments. L’eina de treball més utilitzada és la PCR de temps real, mitjançant la qual es creen protocols d’identificació ràpids i fiables de la presència d’aquests microorganismes en els aliments. El treball anterior és un bon exemple del procediment que sol dur a terme en les seves investigacions.

A més de la realització d’aquests protocols, s’assaja amb l’ús de propidi de monoazida (PMA) combinat amb una PCR en temps real. El PMA s’intercala amb el DNA extracel·lular ja que és impermeable a la membrana i, per tant, inaccessible al DNA intracel·lular. En intercalar-se en el DNA extracelul·lar aquest no pot ser replicat en una PCR i, per tant, només es formarà producte a partir de DNA intracel · lular.

Dit d’una altra manera, el tractament d’una mostra amb PMA abans d’una qPCR permet que DNA de microorganismes morts no sigui replicat i només es formi producte de DNA provinent de cèl·lules vives.

La tècnica PMA-qPCR ha estat provada com a mètode substitutiu al recompte en placa com a mètode d’avaluació de procediments desinfectants en els últims treballs realitzats per aquest equip d’investigació com aquest de açí o aquest altre.The action of microorganism in the production of food and their alteration in many ways shows the important role of food microorganisms. Degradation and food spoilage causes economic losses and creates risks in human health. For this reason they actively develop microbiological detection techniques and microbiological control of food.

Leuconostoc mesenteroides is a lactic acid bacterium (LAB) gram-positive, as the entire genus Leuconostoc which can cause infections in humans due to the rare presence of this bacterium in some meat products. Thus commercial detection kits of microorganisms do not usually detect this microorganism. For this reason they developed a protocol to identify this bacterium. They based on a real-time PCR (qPCR) with TaqMan probes. TaqMan probes identified a specific PCR product by fluorescence. They worked with the 23S rRNA gene, using this gene to develop qPCR primers and a TaqMan probe. They tested the specificity of this protocol with DNA from other Leuconostoc bacteria and DNA of different source. Their tests show the new protocol can detect the presence of Leuconostoc mesenteroides in meat products with a minimum threshold of 10 ^ 4 CFU / g, or 10 ^ 4 colony-forming units per gram.

This work was performed by Rosa Aznar Novella, who is a full professor in the Department of Microbiology and Ecology, University of Valencia. Their research team focuses on early detection of bacteria and other microorganisms in food. The real time PCR is their main working tool used, which protocols are quickly and has a reliable identification of the presence of microorganisms in food. This  is a good example of how  they works.

Also, they assayed using propidium monoazide (PMA) combined with a real-time PCR. This dye is nearly completely cell membrane-impermeable, and thus can be selectively used to intercalated in DNA Extracellular from dead cells while leaving DNA from viable cells intact. This feature makes the dye highly useful in the selective detection of viable cells by quantitative real-time PCR in the presence dead cells whose DNA has been PMA-modified and thus cannot be amplified.

The PMA-qPCR technique has been tested by this research team as an alternative method to plate count as a evaluation method for disinfectant procedures.

Deja un comentario

Tu dirección de correo electrónico no será publicada. Los campos obligatorios están marcados con *


¡IMPORTANTE! Responde a la pregunta: ¿Cuál es el valor de 6 4 ?